原理

乳酸桿菌生長(zhǎng)需要特別的營(yíng)養(yǎng)，因而在非選擇性培養(yǎng)基上很難生長(zhǎng)。維生素測(cè)定用培養(yǎng)基用于維生素的微生物法測(cè)定。該方法需要三種培養(yǎng)基：即維持培養(yǎng)基，用于保持菌種活力；接種培養(yǎng)基，用于測(cè)試菌液的制備；測(cè)定用培養(yǎng)基，用于待測(cè)維生素的定量。

維生素B12測(cè)定用培養(yǎng)基                        

維生素B12測(cè)定用培養(yǎng)基，不含維生素B12，但包含所有其他維生素和必要養(yǎng)分，用于萊士曼乳酸桿菌（ATCC 7830）的生長(zhǎng)。萊士曼乳酸桿菌（ATCC 7830）作為測(cè)定用菌，zui早由Capp等人描述（1）并被美國(guó)藥典和美國(guó)分析化學(xué)家協(xié)會(huì)（AOAC）所推薦（2，3）。

用已知稀釋度的維生素B12標(biāo)準(zhǔn)品，可以制備標(biāo)準(zhǔn)曲線（2，3）。

測(cè)試菌液的制備是將將活化后的菌株接種到乳酸桿菌肉湯培養(yǎng)基中，推薦在37°C 孵育24 小時(shí)，再離心、清洗、重懸于10 ml 生理鹽水中，再通過濁度分析或酸度分析，確定生長(zhǎng)反應(yīng)。

  用維生素B12的濃度及對(duì)應(yīng)的吸光度制作標(biāo)準(zhǔn)曲線。用標(biāo)準(zhǔn)曲線可確定待測(cè)樣本中的維生素B12的濃度。

應(yīng)非常小心地避免培養(yǎng)基和玻璃器具的污染。應(yīng)使用潔凈的無去污劑的玻璃器具。少量的外源物質(zhì)的污染可能導(dǎo)致錯(cuò)誤的結(jié)果。

用于接種的測(cè)定菌應(yīng)在的培養(yǎng)基中培養(yǎng)。

應(yīng)用

維生素B12測(cè)定用培養(yǎng)基推薦采用萊士曼氏乳酸桿菌（ATCC 7830）作為測(cè)定用菌，進(jìn)行維生素B12的微生物法測(cè)定。

培養(yǎng)基組分

成分                                     克/升

無維生素酸水解酪蛋白                 15.000

葡萄糖                               40.000

天門冬酰胺                           0.200

醋酸鈉                               20.000

抗壞血酸                             4.000

L-胱氨酸                             0.400

DL-色氨酸                            0.400

硫酸腺嘌呤                           0.020

尿嘧啶                               0.020

黃嘌呤                               0.020

核黃素（維生素B2）                   0.001

鹽酸硫胺素                           0.001

生物素                               0.00001

煙酸                                 0.002

對(duì)氨基苯甲酸（PABA）                0.002

泛酸鈣                               0.001

鹽酸吡哆醇                           0.004

鹽酸吡哆醛                           0.004

鹽酸吡哆胺                           0.0008

葉酸                                 0.0002

磷酸二氫鉀                           1.000

磷酸氫二鉀                           1.000

硫酸鎂                               0.400

氯化鈉                               0.020

硫酸亞鐵                             0.020

硫酸錳                               0.020

聚山梨酯80                           2.000

鹽酸鳥嘌呤                           0.020

zui終pH值 (25°C)                     6.1±0.2

質(zhì)量控制

Ø外觀——奶油色至黃色，具均勻性，傾向形成可容易分解成粉末狀的軟塊

Ø制備好的培養(yǎng)基顏色和透明度——淡琥珀色透明溶液，可能有輕微沉淀

Ø配比濃度——在25°C下8.5%w/v(8.5g/100ml水）水溶液，pH值為6.1±0.2

ØpH值——5.90-6.30

配置

稱取8.45g干粉培養(yǎng)基溶于100ml蒸餾水，必要時(shí)加熱使培養(yǎng)基*溶解。混勻，使輕微的沉淀均勻分布。測(cè)定時(shí)，分裝試管，每管為5ml培養(yǎng)基（包含標(biāo)準(zhǔn)品和待測(cè)樣品）。加蒸餾水，使總體積達(dá)到10ml。高壓消毒15磅121°C 5分鐘。立即冷卻培養(yǎng)基。每個(gè)試管(10 ml)的維生素B12水平為0、0.025、0.05、0.075、0.1、0.125、0.15、0.2 ng時(shí)，均可獲得滿意結(jié)果。

培養(yǎng)反應(yīng)

進(jìn)行微生物法測(cè)定維生素B12。采用萊士曼氏乳酸桿菌（ATCC 7830），35-37°C孵育18-24小時(shí)。

生長(zhǎng)狀況

隨著測(cè)定管標(biāo)準(zhǔn)品水平升高，（美國(guó)藥典維生素B12標(biāo)準(zhǔn)水平，0，0.025,0.050，0.075,0.1,0.125,0.150,0.2ng)，目標(biāo)菌生長(zhǎng)逐漸遞增，伴隨著620nm處吸光度的增加。

文獻(xiàn)

1.  Capps B. E., Hobbs M. H. H. and Fox S. H., 1949, J. Biol. Chem., 178:517.

2. The United States Pharmacopoeia, 2006, USP29/NF24, The United States Pharmacopeial Convention, Rockville, MD.

3.  H. Williams, (Ed.), 2005, Official Methods of Analysis of the Association of Official Analytical Chemists, 19th Ed., AOAC,Washington, D.C