目前有研究發(fā)現(xiàn)，腫瘤細(xì)胞可以通過(guò)組蛋白修飾、DNA 甲基化和染色質(zhì)結(jié)構(gòu)改變等協(xié)同作用，通過(guò)表觀調(diào)控實(shí)現(xiàn)免疫逃逸。前期研究發(fā)現(xiàn)動(dòng)態(tài)可逆的 RNA m6A 甲基化與腫瘤發(fā)生和轉(zhuǎn)移之間存在密切聯(lián)系。考慮到 m6A 甲基化的可逆性，研究團(tuán)隊(duì)推測(cè)腫瘤會(huì)通過(guò)調(diào)控 m6A 甲基化過(guò)程來(lái)改變腫瘤微環(huán)境。然而，腫瘤自身的（Tumor intrinsic） RNA 表觀轉(zhuǎn)錄組是否參與免疫逃逸仍是未知的。

2021 年 4 月 27 日，清華大學(xué)徐萌團(tuán)隊(duì)聯(lián)合中科院北京基因組研究所韓大力團(tuán)隊(duì)，中科院上海藥物研究所楊財(cái)廣團(tuán)隊(duì)共同在 Cell 子刊 Cell Metabolism 發(fā)表題為 Tumors exploit FTO-mediated regulation of glycolytic metabolism to evade immune surveillance 的研究論文。

研究人員首先分析了 TCGA 數(shù)據(jù)庫(kù)的黑色素瘤（SKCM）數(shù)據(jù)，利用五個(gè)基因（CD8A, CD8B, GZMA, GZMB, and PRF1）定義了 cytotoxic T lymphocyte (CTL) score，反映腫瘤浸潤(rùn) CD8+ T 細(xì)胞的功能。

研究發(fā)現(xiàn)在表觀轉(zhuǎn)錄組調(diào)控因子中，RNA 去甲基化酶 FTO 與 CTL score 呈現(xiàn)負(fù)相關(guān)。為了檢測(cè)腫瘤細(xì)胞的 FTO 表達(dá)是否影響 T 細(xì)胞介導(dǎo)的抗腫瘤功能，研究人員在 B16-OVA 黑色素瘤細(xì)胞和肺癌細(xì)胞系 LLC 中對(duì) FTO 進(jìn)行敲降。研究人員將 B16-OVA 和 LLC 接種到小鼠體內(nèi)，發(fā)現(xiàn) Fto-Kd 細(xì)胞產(chǎn)生的腫瘤生長(zhǎng)速度明顯減慢。

為進(jìn)一步評(píng)估適應(yīng)性免疫應(yīng)答在抑制腫瘤生長(zhǎng)中發(fā)揮的作用，研究人員將 Fto-Kd 腫瘤細(xì)胞接種在免疫缺陷 Rag2-/- 小鼠中，發(fā)現(xiàn)對(duì)照細(xì)胞和 Fto-Kd 的腫瘤體積相同，表明 Fto-Kd 介導(dǎo)的抑制腫瘤與適應(yīng)性免疫應(yīng)答相關(guān)。

研究人員通過(guò)流式細(xì)胞術(shù)分析了腫瘤浸潤(rùn)的骨髓衍生細(xì)胞（單核細(xì)胞，巨噬細(xì)胞和樹(shù)突細(xì)胞）和 T 細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)在 Fto-Kd B16-OVA 和 LCC 腫瘤中 CD4 + 和 CD8+ T 細(xì)胞浸潤(rùn)明顯增加。測(cè)定 IFN-γ 和 granzyme B 的產(chǎn)生來(lái)評(píng)估腫瘤浸潤(rùn)性 CD8+ T 細(xì)胞的功能，發(fā)現(xiàn) Fto-Kd 腫瘤細(xì)胞 IFN-γ 和 granzyme B 陽(yáng)性的 T 細(xì)胞增多。

這些結(jié)果表明在腫瘤中 FTO 的缺失導(dǎo)致 CD8+ T 細(xì)胞浸潤(rùn)和其介導(dǎo)的細(xì)胞毒性增加。

為檢測(cè)腫瘤固有 FTO 對(duì) T 細(xì)胞的影響，研究人員對(duì) B16-OVA 細(xì)胞和 抗原特異性 CD8+T 細(xì)胞進(jìn)行共培養(yǎng)，隨后通過(guò)流式對(duì) CD8+ T 細(xì)胞進(jìn)行分選并進(jìn)行 RNA-seq。

轉(zhuǎn)錄組分析顯示，F(xiàn)TO 敲降導(dǎo)致 CD8+ T 細(xì)胞發(fā)生顯著改變：1420 個(gè)基因上調(diào)和 1101 個(gè)基因下調(diào)。其中細(xì)胞因子和細(xì)胞毒性分子（IL-2, IFN-γ 和 granzyme B）的表達(dá)增加。通過(guò)對(duì) CD8+ T 細(xì)胞效應(yīng)特征基因進(jìn)行基因集富集分析發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)to-Kd 導(dǎo)致 T 細(xì)胞激活并且增加了 T 細(xì)胞殺傷效果。

這些結(jié)果表明腫瘤固有的 FTO 功能作為抑制因子，限制了 T 細(xì)胞的激活和效應(yīng)狀態(tài)。

腫瘤通常利用糖酵解來(lái)促進(jìn)自身快速生長(zhǎng)，同時(shí)腫瘤細(xì)胞消耗葡萄糖會(huì)限制 T 細(xì)胞代謝，通過(guò)直接抑制其效應(yīng)功能，從而促進(jìn)腫瘤惡化。為檢測(cè) FTO 是否通過(guò)改變糖酵解從而限制 T 細(xì)胞的激活，研究人員測(cè)定了腫瘤細(xì)胞糖酵解的能力，發(fā)現(xiàn) Fto-Kd 細(xì)胞顯著降低癌細(xì)胞糖酵解的能力。

研究人員通過(guò) RNA-seq 探究 Fto-Kd 如何抑制糖酵解能力，發(fā)現(xiàn)在 Fto-Kd 細(xì)胞中，糖酵解途徑相關(guān)基因明顯下調(diào)。由于 MYC 和 bZIP 家族轉(zhuǎn)錄因子可以轉(zhuǎn)錄激活糖酵解基因，研究人員發(fā)現(xiàn) Kto-Kd 細(xì)胞中 bZIP 家族轉(zhuǎn)錄因子 Jun，Cebpb 和 Junb 在 RNA 和蛋白水平均發(fā)生下調(diào)。為了驗(yàn)證轉(zhuǎn)錄因子與 T 細(xì)胞活化的關(guān)系，研究人員在 Fto-Kd 細(xì)胞中過(guò)表達(dá) Junb，發(fā)現(xiàn)抑制了 T 細(xì)胞活化，而使用 2-DG 阻斷腫瘤糖酵解后，抑制的 T 細(xì)胞活化明顯被恢復(fù)。

這些結(jié)果表明 Fto-Kd 通過(guò)抑制糖酵解轉(zhuǎn)錄因子導(dǎo)致 T 細(xì)胞活化增強(qiáng)。

為進(jìn)一步探究 FTO 與轉(zhuǎn)錄因子之間的調(diào)控關(guān)系，研究人員對(duì) B16-OVA 腫瘤細(xì)胞進(jìn)行 M6A-seq。通過(guò)計(jì)算每個(gè)峰 m6A 比率，研究人員發(fā)現(xiàn) Fto 敲降導(dǎo)致 m6A 甲基化整體增加。研究人員進(jìn)一步挑選了 83 個(gè) FTO-m6A 直接調(diào)控基因進(jìn)行 GO 分析，發(fā)現(xiàn) DNA 結(jié)合和轉(zhuǎn)錄激活顯著富集，包括 bZIP 轉(zhuǎn)錄因子 Jun 和 Cebpb。

為了分析這些 mRNA 中 m6A 增加是否與 FTO 直接相關(guān)，研究人員在腫瘤細(xì)胞中過(guò)表達(dá)了 CRISPR-dCas13 融合蛋白，發(fā)現(xiàn)在 gRNA-Cebpb-JunB 和 dCas13b-FTO 共轉(zhuǎn)染時(shí)，JunB 和 C/EBPβ 及下游糖酵解基因顯著上調(diào)，這些結(jié)果表明 FTO 通過(guò)去甲基化 Junb 和 Cebpb 來(lái)調(diào)控下游糖酵解基因。

已有報(bào)道表明 FTO 抑制劑具有明顯的抗腫瘤效果，然而目前還沒(méi)有研究探究在免疫腫瘤微環(huán)境中使用 FTO 抑制劑激活 T 細(xì)胞。因此，研究人員優(yōu)化了 FTO 抑制劑得到了 Dac51。體外實(shí)驗(yàn)表明，Dac51 對(duì) FTO 去甲基化活性具有良好的抑制活性。

此外，研究人員還測(cè)定了 FTO 和 Dac51 配合物的晶體結(jié)構(gòu)，發(fā)現(xiàn) Dac51 的異羥肟酸與 Ser229 之間存在額外的氫鍵，可能導(dǎo)致 Dac51 與 FTO 的結(jié)合顯著增強(qiáng)。Dac51 處理與 Fto 敲降對(duì)糖酵解代謝的抑制水平相似。

這些結(jié)果表明 Dac51 可以作為一種有效的 FTO 抑制劑，通過(guò)抑制 FTO 介導(dǎo)的 Jun 和 Cebpb 轉(zhuǎn)錄本的去甲基化，抑制腫瘤細(xì)胞的糖酵解能力。

為了確定 Dac51 是否具有類(lèi)似 Fto 敲降的抗腫瘤作用，研究人員進(jìn)行體外共培養(yǎng)試驗(yàn)。在與 Dac51 預(yù)處理的 B16-OVA 腫瘤細(xì)胞共培養(yǎng)的 T 細(xì)胞中，發(fā)現(xiàn)細(xì)胞因子釋放增強(qiáng)，細(xì)胞毒性提高。研究人員探究 Dac51 對(duì)患者來(lái)源類(lèi)器官（patient-derived organoids，PDOs）的影響時(shí)發(fā)現(xiàn)，Dac51 處理后 c-Jun，C/EBPb 和 JunB 表達(dá)降低，編碼糖酵解酶基因（LDHA 和 PFKP）同樣下調(diào)，而 T 細(xì)胞激活增加。

為評(píng)估 Dac51 對(duì)體內(nèi)腫瘤模型的抗腫瘤作用，研究發(fā)現(xiàn) Dac51 治療可有效的抑制腫瘤在體內(nèi)生長(zhǎng)。此外，研究人員還探究了 Dac51 和免疫檢查點(diǎn)阻斷劑聯(lián)合治療的效果，發(fā)現(xiàn)聯(lián)合治療腫瘤生長(zhǎng)減慢，小鼠總體生存期延長(zhǎng)。

這些結(jié)果表明，強(qiáng)效的 FTO 抑制劑 Dac51 可傳遞 T 細(xì)胞介導(dǎo)的抗腫瘤作用，并通過(guò)記憶 T 細(xì)胞反應(yīng)防止腫瘤復(fù)發(fā)。

本研究證明 Dac51 可以作為 FTO 抑制劑并阻礙 Jun，Junb 和 Cebpb 的表達(dá)，從而防止已知的破壞腫瘤內(nèi) T 細(xì)胞效應(yīng)功能的代謝限制。提出了 Dac51 和 T 細(xì)胞功能增強(qiáng)子結(jié)合，如檢查點(diǎn)阻斷劑和其他免疫原性傳統(tǒng)療法，可能是協(xié)調(diào)改善適應(yīng)性免疫應(yīng)答的有效策略。研究人員發(fā)現(xiàn) RNA 轉(zhuǎn)錄組可以作為免疫逃避的另一層遺傳調(diào)控，這將有助于發(fā)現(xiàn)一類(lèi)潛在的轉(zhuǎn)錄組免疫治療靶點(diǎn)。

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