細胞培養物被支原體污染是經常發生的。在細胞培養物中消除、滅活或抑制支原體常用的方法是用抗生素處理。

然而，一般來說，單靠抗生素處理不能長久地消除支原體。此外，抗生素的細胞毒性可在真核細胞中引起不良反應，并可能促進耐藥支原體菌株的發展。因此推薦使用，針對支原體起作用的支原體清除試劑——Mynox®  Gold。

產品名稱：珍貴細胞株 清除支原體試劑

英文：Mynox® Gold Mycoplasma Elimination Reagent

品牌：Minerva-Biolabs®    

貨號：10-0201

規格：2套/盒    

Mynox® Gold代表了經典Mynox®試劑的進一步發展，將抗生素和生物試劑與生物物理作用模式相結合，從而盡可能殺滅細胞中的支原體。

與其他細菌細胞相比，支原體沒有細胞壁，但被質膜包圍。Mynox® Gold中含有的生物試劑可整合到支原體膜中，并損害其完整性。由于這種聯合配方，生物試劑和抗生素的有效劑量可以降低到更低的細胞毒性，同時仍然可靠和明確地消除支原體。

該試劑的生物物理作用模式將耐藥菌株的發展風險降至可忽略不計的水平。

Mynox® Gold的一次應用包括4個小瓶：1個『治療液』和2個『鞏固液』，每種成分都是無菌的即用型溶液。『治療液』破壞大部分支原體顆粒，而『鞏固液』不可逆轉地破壞所有剩余顆粒，將支原體從處理過的細胞培養物中消除。兩種處理方法對培養的細胞都是無害的。

以下方法步驟是為需要標準培養基的典型細胞培養而設計的，可用于貼壁和懸浮細胞系，個別情況下可能需要對這些程序進行修改和優化。

一、『治療液』混合物的制備

1.將4.5 ml含5% v/v FCS的標準細胞培養基移入15ml無菌錐形離心管中，并加入500µl Mynox®Gold Starter Treatment(橙紅色蓋的小瓶)。

2.旋渦Mynox® Gold/培養基混合物。

3.將Mynox® Gold培養基混合物(5ml)轉移到無菌25平方厘米細胞培養瓶或無菌6cm培養皿中。

二、制備細胞

1.像往常一樣傳代細胞，用胰蛋白酶分離細胞團，獲得單個細胞。

2.將含有5% (v/v) FCS的5ml細胞培養基中的10^4 - 10^5個單細胞轉移到Mynox®Gold培養基混合物中。處理混合物的總容積為10 ml，最終FCS濃度為5% (v/v)。

3.輕輕地前后左右搖動燒瓶或培養皿，以避免細胞分布不均勻。像往常一樣孵育細胞，然后進行Mynox® Gold鞏固處理。

三、鞏固處理

1.培養細胞至80 - 90%的融合度。

2.以常規方式傳代。向含新鮮培養基的9.5 ml傳代細胞中，加入500µl Mynox®Gold『鞏固液』試劑(白色透明帽的小瓶)。調整FCS濃度。不再需要添加5% (v/v)的FCS。

3.重復Mynox® Gold鞏固處理2次以上。在第3次治療后(從起始處理開始共4代)，支原體消除程序完成。

四、支原體檢測

1. Mynox® gold處理的細胞培養物和病毒庫需要在不含支原體抗生素的情況下再培養4代，然后才能檢測支原體是否再次出現。對于高靈敏度的支原體污染檢測，我們推薦使用基于PCR的Venor®GeM支原體檢測試劑盒

2.  定期重復PCR支原體檢測試驗，以確保維持無支原體的細胞培養。

??由于Mynox®Gold的作用模式是基于其與支原體膜的物理絡合作用，因此有效的治療需要試劑與支原體顆粒直接接觸。應避免治療細胞團。支原體可以積聚在細胞間隙以及細胞膜的口袋和縫隙中，從而逃避與藥物的接觸。在對細胞進行消化處理時，需要在顯微鏡下檢查，確保對單個細胞的處理。如有必要，增加胰蛋白酶處理的持續時間或通過仔細上下移液機械分解細胞團。

??用于處理的細胞總數不應超過10^5個細胞(每個25平方厘米的細胞培養瓶或6厘米的培養皿)。這保證了低支原體負荷。

??向『治療液』中添加細胞時，應將移液管直接插入治療混合物中，以避免氣溶膠。注意不要用吸管頭接觸燒瓶內壁或培養皿內壁。

??支原體去除處理后，不應直接使用基于PCR的檢測方法。Mynox® Gold溶解支原體顆粒，隨后將支原體DNA釋放到培養基中。然后可以通過PCR檢測到游離DNA，導致假陽性結果。

??Mynox® Gold的效果，受反應混合物中脂質和蛋白質濃度的影響，例如，培養基補充劑的成分，如胎牛血清(FCS)。這些成分競爭性地結合Mynox® Gold中所含的生物試劑，并防止其與支原體膜結合。因此，我們建議，在細胞培養基中使用5% v/v FCS進行。由于血清蛋白和脂質成分的抑制作用，目前還沒有針對高蛋白和脂質濃度生物制劑的治療方案。

??細胞培養基的類型不影響處理的效率。抗生素，特別是在需要選擇的情況下，可以在治療混合物中使用。