真菌是一類具真核和細胞壁的異養生物。真菌可以通過孢子延續種群，典型的營養體為絲狀分支結構。可污染細胞培養基的真菌種類繁多，最常見的有曲霉菌，白色念珠菌，酵母菌，黑霉菌，孢子菌等。

與其他類型的污染相比，真菌污染的癥狀明顯不同且更易觀察。

在培養基中會形成淡黃色或白色的漂浮物，肉眼可見，較易被發現；

短期內培養液多不變混濁；

顯微鏡下可以看見細胞之間或是培養基中，有縱橫交錯穿行的絲狀，樹枝狀或管狀菌絲；

多數菌絲在高倍鏡下可以觀察到鏈狀排列的菌株，而念珠菌及酵母菌菌株呈卵圓形，散落在細胞上及細胞周邊生長。

真菌污染的鑒定，需要將待檢測的細胞培養基，接種在真菌專用培養基上進行鑒定，例如：馬丁培養基、沙氏培養基等。

與處理細菌污染的原則一致，細胞培養物一旦發生真菌污染，建議舍棄培養物。應盡快把污染細胞與其它細胞系隔離開，不要打開培養皿，以免孢子飛出；同時需要對實驗過程中所用的器材、試劑和操作空間做相應處理：消毒液噴灑、紫外線消毒、高溫滅菌等。

如果細胞不能被丟棄，需要進行除真菌處理，請注意：高濃度的抗生素或是抗菌素（兩性霉素 B 、泰樂菌素等）對細胞會產生一定毒性，在使用前可以進行劑量反應實驗確定影響。

因此，發生真菌污染，盡量丟棄培養環境中的全部細胞。