一、前期準備

1. 實驗環境準備：對細胞培養室進行清潔消毒，開啟超凈工作臺紫外燈照射30分鐘以上，照射結束后關閉紫外燈，通風15-20分鐘。同時檢查培養箱、離心機、倒置顯微鏡等設備，確保其參數正常（如培養箱溫度37℃、CO?濃度5%）。

2. 試劑與耗材準備：提前將培養基、血清、胰酶、PBS緩沖液等試劑從冰箱取出，置于室溫下平衡至室溫（或按試劑要求進行預熱）。培養瓶、離心管、移液管等耗材需經滅菌處理，確認無破損、污染后備用。

3. 個人防護：實驗人員穿戴無菌實驗服、手套、口罩，規范進行手部消毒，避免人為污染。

二、細胞復蘇（若使用凍存細胞）

1. 從液氮罐中取出凍存管，迅速放入37℃恒溫水浴鍋中，快速搖晃使管內凍存液在1-2分鐘內全部融化。

2. 融化后的細胞懸液轉移至含有預熱培養基的離心管中，輕輕吹打混勻，以1000-1200rpm的速度離心5-8分鐘。

3. 離心結束后，棄去上清液，加入適量新鮮培養基，用移液管輕輕吹打細胞沉淀，使其分散成單細胞懸液。

4. 將細胞懸液轉移至無菌培養瓶中，補充適量培養基，輕輕搖勻后放入培養箱中培養，次日觀察細胞貼壁及生長情況。

三、細胞傳代

1. 觀察細胞：通過倒置顯微鏡觀察培養瓶中的細胞，當細胞匯合度達到80%-90%時，即可進行傳代。

2. 清洗細胞：棄去培養瓶中的舊培養基，加入適量PBS緩沖液，輕輕搖晃培養瓶，清洗細胞表面殘留的培養基及血清，隨后棄去PBS緩沖液，重復清洗1-2次。

3. 消化細胞：向培養瓶中加入適量胰酶消化液，確保消化液均勻覆蓋細胞表面，置于37℃培養箱中孵育1-3分鐘，期間可通過顯微鏡觀察細胞形態變化，當細胞變圓、間隙增大時，立即加入適量含血清的培養基終止消化。

4. 吹打分散：用移液管輕輕吹打培養瓶壁上的細胞，使細胞全部脫落并分散成單細胞懸液，避免用力吹打導致細胞損傷。

5. 離心分裝：將細胞懸液轉移至離心管中，1000-1200rpm離心5-8分鐘，棄去上清液，加入新鮮培養基重懸細胞。根據實驗需求，將細胞懸液分裝至新的培養瓶中，補充培養基后搖勻，放入培養箱繼續培養。

四、細胞換液

1. 當培養基顏色變為黃色（pH值下降）或細胞生長至一定階段時，需進行換液。

2. 打開超凈工作臺，取出培養瓶，輕輕傾斜培養瓶，使舊培養基匯集在一側，用移液管緩慢吸棄舊培養基。

3. 加入適量PBS緩沖液清洗細胞1次，棄去PBS后，加入預熱的新鮮培養基，搖勻后放入培養箱中繼續培養。

五、細胞收集與處理（根據實驗需求）

1. 若需收集細胞，按細胞傳代步驟進行消化、終止消化及離心，獲得細胞沉淀。

2. 對細胞沉淀進行后續處理，如加入細胞裂解液提取蛋白、加入固定液進行染色觀察，或用于其他實驗操作。

六、實驗后整理

1. 及時清理超凈工作臺，將使用過的耗材分類處理（如污染耗材進行滅菌后丟棄，可重復使用耗材按規定清洗滅菌）。

2. 關閉實驗設備，記錄細胞培養情況（如細胞種類、代數、生長狀態、操作內容等），確保實驗數據完整可追溯。

3. 再次清潔培養室環境，保持實驗區域整潔，為后續實驗提供無菌條件。